嘔吐毒素檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）使用說明書：

1、原理及用途：

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇又稱嘔吐毒素，由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生，常出現(xiàn)在玉米(穗腐病)、小麥和大麥(赤霉病)上。我國谷物中DON的標(biāo)準(zhǔn)為1.0mg/kg。

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測大米、小米、面等谷物及飼料樣本中的嘔吐毒素(Deoxynivalenol，DON)，試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液，樣本中的嘔吐毒素和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗嘔吐毒素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含嘔吐毒素含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中嘔吐毒素的殘留量。

2、技術(shù)指標(biāo)：

2.1、試劑盒靈敏度：10ppb(ng/ml)

2.2、反應(yīng)模式：25℃，30～15min

2.3、檢測下限：

谷物、飼料…………………………………200ppb

2.4、交叉反應(yīng)率：

嘔吐毒素……………………………………100%

3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇……………<1%

2.5、樣本回收率：

谷物、飼料……………………………85%±15%

3、試劑盒組成：

酶標(biāo)板………………………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)品(黑蓋)：各1ml

0ppb、10ppb、30ppb、90ppb、270ppb、810ppb

酶標(biāo)記物(紅蓋)…………………5.5ml

抗體工作液(藍(lán)蓋) ………………5.5ml

底物液A(白蓋)……………………6ml

底物液B(黑蓋)……………………6ml

終止液(黃蓋)………………………6ml

20×濃縮洗滌液(白蓋)……………40ml

復(fù)溶液(黃蓋)………………………50ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個(gè)

4、需要的器材和試劑：

4.1、儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)

4.2、微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

5、樣本前處理：

5.1、樣本處理前須知：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5.2、配液：

配液1：工作洗滌液

將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)

5.3、樣本前處理步驟：

5.3.1、谷物（大米、玉米、小米、麥麩等）及飼料處理方法

1)稱取2g±0.05g粉碎樣本于50ml離心管中，加20ml去離子水，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘

2)取0.5ml上清，加入0.5ml復(fù)溶液，混勻

3)取50µl進(jìn)行分析

樣本稀釋倍數(shù)：20，檢測下限：200ppb

注：由于毒素在樣本中的分布呈非均勻狀態(tài)，取樣時(shí)需多點(diǎn)取樣充分混勻后再取2g進(jìn)行試驗(yàn)

6、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟：

將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上，洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃

6.1、編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置

6.2、加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘

6.3、洗滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350µl工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干(用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)

6.4、顯色：每孔加入底物液A50µl，再加底物液B50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘(若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間)

6.5、終止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)

6.6、測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值(建議用雙波長450/630nm)。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成

7、結(jié)果分析：

7.1、百分吸光率的計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液(0ppb)的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值(%)=A/A0×100%

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算：

以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析(歡迎來電索取)

8、注意事項(xiàng)：

8.1、室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫(25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低

8.2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作

8.3、混合要均勻，洗板要che底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性

8.4、在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射

8.5、不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑

8.6、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位(A450nm< 0.5 )時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)

8.7、反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚

9、嘔吐毒素檢測試劑盒貯藏及保存期：

儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保質(zhì)期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。